科研服務
SCIENTIFIC SERVICE
病毒包裝
干擾慢病毒/過表達慢病毒構建
1.服務描述
干擾慢病毒構建：一般情況下，RNA干擾實驗是通過化學合成小片段siRNA，或者構建shRNA表達質粒，通過轉染試劑介導進入細胞實現RNA干擾。但是這兩種方式對于難轉染的細胞（例如原代細胞，干細胞，懸浮細胞等）往往因為轉染效率低而導致RNA干擾實驗失敗。而通過構建慢病毒shRNA干擾質粒并包裝病毒，再用病毒侵染靶細胞能很好的解決這一難題。
過表達慢病毒構建：cDNA過表達慢病毒包裝是根據客戶提供的目的基因信息，將其構建至所需的慢病毒過表達載體中，與其余的慢病毒包裝輔助質粒共同轉染HEK293T細胞包裝獲得過表達目的基因的慢病毒顆粒。
2.服務內容（干擾/過表達）
1：shRNA干擾靶點序列的設計/目的基因調??；
2：shRNA 慢病毒質粒的構建/過表達慢病毒質粒的構建；
3：shRNA慢病毒包裝與病毒滴度測定/過表達慢病毒包裝與病毒滴度測定；
3.服務說明
1：我們的RNA干擾及過表達服務針對所有的哺乳動物細胞，暫不提供植物和原核生物的RNA干擾服務；
2：對象可以是編碼蛋白的mRNA序列，也可以是長的非編碼RNA(lncRNA)序列；
3：針對不同的靶基因，我們一般設計3-4條干擾序列，保證至少有一條序列干擾效果大于70%（RNA水平）。也可由客戶提供干擾靶點，但我們不保證干擾效果；
4：我們提供多個慢病毒載體供客戶選擇（見下方載體信息）；
5：我公司包裝的shRNA干擾慢病毒顆粒滴度可以達到1×109TU/ml，完全能夠滿足動物實驗；
4.客戶所得
1：構建好的shRNA/過表達質粒及對照質粒；
2：合同規定量的慢病毒顆粒及對照病毒顆粒；
3：完整的實驗報告（包括實驗材料，實驗步驟，實驗結果等）；
5.載體信息
干擾慢病毒構建從靶點設計到慢病毒滴度測定完成需21個工作日；
過表達慢病毒構建從基因調取到慢病毒滴度測定完成需27個工作日；
miRNA 的過表達慢病毒包裝
1.服務描述
microRNA(miRNA)是一類小片段單鏈RNA , 最初是在核內由RNA聚合酶轉錄形成具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAA)的pri-miRNA，pri-miRNA在核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha的作用下被處理成約70個核苷的pre-miRNA。pre-miRNA被運輸出核后再由另外一個核酸酶Dicer將其剪切形成約22個核苷酸的成熟miRNA。成熟的miRNA 與RISC組裝成RNA誘導的沉默復合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。
圖示：miRNA的成熟過程
2.服務內容
1：miRNA 的過表達慢病毒包裝
我公司采用擴增pri-miRNA及其兩端的天然側翼序列來構建miRNA的過表達質粒，并包裝慢病毒。以實現miRNA在體外(內)的高表達。該方法相比化學合成的miRNA，具有可持續性表達，并且能用于難轉染(例如干細胞，懸浮細胞等)細胞等優點。比pre-miRNA和mature miRNA 形式的過表達，具有表達效果更好，更能模擬體內天然的成熟過程。
2：miRNA的抑制
我公司采用TuD RNA(Tough Decoy RNA)的設計方法構建miRNA的抑制慢病毒載體。TuD RNA不同于以往的單鏈RNA，它是含有頸環結構的雙鏈RNA , 能夠抵抗胞內核酸酶的降解，讓miRNA抑制可持續一個月以上。并且，TuD RNA的兩條鏈都包含一個miRNA結合位點，能夠更高效地隔離濃度較低的目標miRNA。因此，相比其它方法，TuD RNA能夠更長效的抑制miRNA。
圖示：TuD RNA的工作原理
3：miRNA的靶基因驗證
由于miRNA是通過其seed sequence(5’端2-8位核苷酸)與靶基因的3’UTR結合抑制靶基因的表達。因此，我們將待定目的基因的3’UTR區域構建至報告基因luciferase的后面，通過比較實驗組和對照組報告基因表達的改變(監測熒光素酶的活性變化)來間接反映miRNA對目的基因的抑制作用。同時結合定點突變等方法進一步確認miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。
3.服務說明
1：客戶只需提供miRBase數據庫中的miRNA編號，我們就可以按照您的要求完成相關實驗。
2：miRNA的過表達效果受諸多因素影響，與對照組相比，可以提高2—1000倍(如果本底表達水平較低，可以達到較好的過表達效果，如果本底表達水平較高，過表達效果會相對較低)。
3：我們提供多個microRNA慢病毒載體供客戶選擇(見下方載體信息);
4.客戶所得
1：符合客戶要求的產品(質粒+甘油菌 或者 病毒+polybrene);
2：完整的電子版實驗報告(包括實驗材料，步驟，載體圖譜等);
3：完整的測序報告;
5.載體信息
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載體編號 |
攜帶標記 |
載體骨架主要元件 |
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熒光 |
真核抗性 |
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MicroRNA過表達慢病毒載體 |
|||
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pHY-LV-miR1.1 |
無 |
無 |
CMV-GFP-MCS |
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pHY-LV-miR1.2 |
GFP |
無 |
CMV-GFP-MCS-PGK- Puromycin |
|
MicroRNA抑制慢病毒載體 |
|||
|
pHY-LV-KD1.1 |
GFP |
無 |
U6-TuD RNA-CMV-GFP |
|
pHY-LV-KD1.2 |
RFP |
無 |
U6- TuD RNA -CMV-RFP |
|
pHY-LV-KD1.4 |
無 |
puromycin |
U6- TuD RNA -CMV-Puromycin |
|
pHY-LV-KD2.1 |
GFP |
無 |
U6- TuD RNA -EF1α-GFP |
|
pHY-LV-KD3.1 |
GFP |
無 |
U6- TuD RNA -UBC-GFP |
|
pHY-LV-KD5.1 |
GFP |
puromycin |
U6- TuD RNA -CMV-GFP-PGK- Puromycin |
|
pHY-LV-KD5.2 |
RFP |
puromycin |
U6- TuD RNA -CMV-RFP-PGK- Puromycin |
|
pHY-LV-KD5.4 |
GFP |
puromycin |
U6- TuD RNA -UBC-GFP-PGK- Puromycin |
|
3’UTR報告基因慢病毒載體 |
|||
|
pHY-LV-Report3.1 |
luciferase |
無 |
CMV-luciferase-MCS |
